Організми роду Mycoplasma належать до класу Mollicutes, які характеризуються відсутністю клітинної стінки та малим розміром геному (0,58−1,4 М п. н.). Виділена від великої рогатої худоби в 1898 році як перший вид Mycoplasma, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides була охарактеризована як збудник заразної плевропневмонії ВРХ. Після майже глобального поширення у XIX столітті Mycoplasma mycoides subsp. mycoides була викорінена на більшості континентів за допомогою політики «стерилізування», однак залишається в багатьох африканських країнах.

Mycoplasma bovis наразі визнана одним із найважливіших і таких, що найчастіше виділяються, видів мікоплазм, пов'язаних із захворюваннями великої рогатої худоби в усьому світі. M. bovis уперше була виділена в Сполучених Штатах Америки в 1961 році з важкого випадку маститу в молочному стаді, де стався спалах, який вразив понад 30% тварин. Кілька інших видів мікоплазм представляють інтерес для великої рогатої худоби з різним ступенем клінічного значення. До них належать Mycoplasma (M) californicum, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. bovoculi, M. leachii (раніше Mycoplasma sp. bovine, група 7), M. dispar, M. canis, M. canadense, M. alkalescens, M. arginini та M. wenyonii. Інші близькоспоріднені види належать до роду Acholeplasma (також представників класу Mollicutes) і часто виділяються разом із видами Mycoplasma. Вони, зазвичай, вважаються забруднювачами та мають мінімальне клінічне значення для великої рогатої худоби, без чітких доказів їхньої здатності викликати захворювання.

У ВРХ мікоплазма може спричинювати мастит, артрит, пневмонію, середній отит та репродуктивні розлади. Клінічний мікоплазмовий мастит часто характеризується множинним ураженням чвертей у поєднанні з відсутністю реакції на лікування. Дорослі тварини та телята також можуть страждати на артрит та пневмонію, тоді як середній отит, зазвичай, спостерігається лише в телят. Ці клінічні прояви можуть спостерігатись одночасно з мікоплазмовим маститом у стаді. Мікоплазму також пов'язують з репродуктивними розладами: вульвовагініт, безпліддя, ендометрит, дистоція.

Висока заразність деяких видів Mycoplasma, їхня погана реакція на лікування та пов'язані з цим наслідки вибракування враженої худоби роблять швидку та точну діагностику важливою для контролю та запобігання спалахам хвороби. В цій публікації обговорюється розробка та використання різних діагностичних методів, доступних для виявлення Mycoplasma у великої рогатої худоби.

Традиційно ідентифікацію та виявлення видів мікоплазм, що вражають велику рогату худобу, проводили за допомогою культивування. Через свою структурну простоту мікоплазми не здатні синтезувати амінокислоти та мають повну або часткову нездатність синтезувати жирні кислоти. Щоб задовольнити цю високу потребу в поживних речовинах, середовища для вирощування мікоплазм є специфічними та часто сильно збагаченими сироваткою, дріжджовим екстрактом, пептоном та іншими добавками з буферизацією до кінцевого pH 7,3−7,8.

Виділення мікоплазм шляхом культивування може бути скомпрометовано надмірним ростом інших швидкорослих бактерій, тому до середовища необхідно додавати антимікробні засоби, такі як ацетат талію або антибіотики.

Інокульовані культуральні середовища інкубують впродовж 7−10 днів при 37 °C та 5% CO₂, що призводить до росту мікроколоній з морфологічним виглядом «яєчні» для більшості видів мікоплазм, які видно за допомогою світлової мікроскопії. Такий вигляд зумовлений тим, що центральна частина колонії вростає в агар і оточується зоною поверхневого росту.

Хоча ідентифікація мікоплазм за допомогою культивування може бути традиційним методом з огляду на відносну простоту та низьку вартість, вона має низку обмежень. Мікоплазми не розмножуються в молоці, тому ріст інших бактерій, присутніх як забруднювачі або як частина змішаної інфекції в зразку, призводить до хибнонегативних результатів. Належний збір, обробка та зберігання зразків є важливими для запобігання або мінімізації надмірного росту інших бактерій в зразку та для максимізації життєздатності та росту мікоплазми на діагностичному середовищі. Зразки слід збирати асептично в стерильні пробірки або контейнери, а потім зберігати при температурі 4 °C та якомога швидше транспортувати до лабораторії для культивування.

Якщо культивування неможливо провести протягом 2 днів, зразки слід заморозити. Заморожування може призвести до зниження відновлення колонієутворюючих одиниць Mycoplasma spp. у зразках молока на 1−2 log¹⁰. Наслідки цієї втрати відновлення будуть різними для окремих клінічних зразків (з імовірно високою концентрацією мікоплазм) порівняно з об'єднаними або зразками танкового молока (з імовірно нижчою концентрацією). В ідеалі, заморожені зразки слід розморожувати при кімнатній температурі, щоб забезпечити максимальне відновлення. Слід враховувати, що повторне заморожування та розморожування спричиняє подальше зменшення кількості життєздатних організмів.

Швидкість відновлення Mycoplasma знижується зі збільшенням часу перед лабораторною обробкою незалежно від того, чи зразки були охолоджені чи заморожені. Причому найкращі показники відновлення досягаються тоді, коли свіжі зразки інокулюють в середовище та інкубують протягом кількох годин після відбору. Якщо зразки не відбирати і не зберігати належним чином, можна отримати хибнонегативні результати культивування.

Проте, навіть за належних протоколів збору та зберігання зразків мікоплазми все ще повільно ростуть, при цьому колонії не видно протягом мінімум 5 днів, а іноді потрібно до 10 днів. Це проблема, адже необхідно швидко діагностувати інфекції для швидкого видалення інфікованих тварин зі стада та мінімізації її передачі. Тому до отримання результатів діагностики тварин з підозрою на інфекцію слід відокремлювати від основного стада і від інших хворих тварин у випадках, не пов'язаних з мікоплазмою.

Щоб мікоплазмову інфекцію можна було діагностувати за допомогою посіву, тварина повинна виділяти життєздатні організми на момент збору зразків. Періодичне виділення часто спостерігається у випадках хронічного та субклінічного мікоплазмового маститу, що може призвести до невдалої постановки діагнозу з одного зразка. В дослідженнях, в яких щодня 28 днів відбирали молоко від 10 хронічно інфікованих тварин, мікоплазми були виділені у 71% збірних зразків молока.

Зустрічалися випадки, коли період без виділення M. bovis у корови з хронічною інфекцією становив 56 днів. Тому, щоб збільшити ймовірність виявлення мікоплазми в випадках хронічного або субклінічного маститу, а також у зразках збірного танкового молока, слід брати кілька зразків протягом кількох днів. Рекомендації щодо відбору проб танкового молока передбачають, що слід зібрати щонайменше 3 зразки з інтервалом 3−4 дні. Якщо всі зразки негативні, оціночна ймовірність негативного результату цього стада становить 70%.

Також може бути проведено групове тестування, при якому молоко збирається з доїльної системи від груп, а не від усього стада. Це може дозволити ідентифікувати інфіковані підгрупи або загони тварин. Однак, залишки молока в трубопроводах від однієї групи можуть спотворити результати наступної, що слід враховувати при інтерпретації результатів.

Хоча додані антимікробні засоби зазвичай пригнічують ріст інших бактеріальних родин, середовища для росту мікоплазми мають потенціал для росту кількох організмів з класу Mollicutes. Наприклад, на середовищах для мікоплазми також ростуть багато видів Acholeplasma, забруднювача навколишнього середовища із сумнівною роллю у патогенезі захворювань. Враховуючи, що більшість видів як Acholeplasma, так і Mycoplasma мають морфологічний вигляд «яєчні», диференціація лише за допомогою культивування не можлива, і це може призвести до хибнопозитивних зразків на мікоплазму.

Чутливість до дигітоніну використовується як додатковий крок для диференціації Mycoplasma від Acholeplasma spp. Однак, інтерпретація чутливості до дигітоніну може бути суб'єктивною. В ідеалі, ідентифікацію виду за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) слід проводити на будь-яких ізолятах, що мають позитивний результат культури.

Бактеріологічний посів та ПЛР-діагностика спираються на демонстрацію наявності мікоплазм. Доступні непрямі ІФА виявляють наявність антитіл до мікоплазми в зразках плазми, сироватки та молока, і їхня мета — виявити тварин, які зазнали впливу патогену та мали час для розвитку гуморальної імунологічної відповіді. Оскільки M. Bovis вважається найпоширенішим та найважливішим видом, значна частина розробок та досліджень специфічна саме для цього виду.

Непрямий ELISA, що оцінює імунну відповідь тварин на M. bovis, є додатковим інструментом, який долає деякі проблеми культивування та ПЛР-аналізу. Оскільки культивування та ПЛР залежать від виділення мікоплазм твариною під час відбору проб, ІФА може виміряти минулий контакт з організмом у формі гуморальної відповіді. Вона зберігається протягом певного періоду часу після інфекції і тому не вимагає виявлення самих мікоплазм, які можуть виділятися періодично або не виділятися взагалі. Як результат, коли ці діагностичні методи використовуються одночасно, часто спостерігається набагато вища поширеність тварин, позитивних до M. bovis.

Наявність антитіл до M. bovis не обов'язково означає, що тварина є носієм або виділяє життєздатний M. bovis. Кількість тварин, які зазнали впливу M. bovis, може бути високою, тоді як частка тварин, які помирають від хвороби або активно виділяють збудника, часто набагато нижча. Крім того, це свідчить про те, що вибракування тварин лише на основі результатів ІФА не є логічним підходом до боротьби зі спалахом і, ймовірно, призведе до надмірної вибраковки. Тому результати ІФА слід інтерпретувати разом з іншими діагностичними підходами.

Результати ІФА на виявлення антитіл можуть бути хибно негативними через недостатній час для сероконверсії, а також відсутність персистенції антитіл. Як правило, сероконверсія відбувається через 2−3 тижні після зараження. Після спалаху захворювання малоймовірно, що всі тварини будуть заражені одночасно. Ці відмінності в часі, ймовірно, призведуть до відмінностей в титрах антитіл по всьому стаду, тому при ухваленні рішення про те, коли відбирати проби у стада та як інтерпретувати результати, необхідно враховувати прогресування впливу патогенів у стаді. Тривалість персистенції антитіл у сироватках крові зберігається щонайменше 27 тижнів після початку спалаху M. bovis та 15 тижнів після останнього клінічного випадку.

Однак, персистенція антитіл у зразках молока є не такою тривалою: в молоці від цих же тварин лише 2% мали позитивний результат на антитіла до M. bovis у молоці. Це свідчить про те, що рівні антитіл до M. bovis, ймовірно, будуть набагато нижчими або, можливо, відсутніми в зразках молока порівняно зі зразками сироватки, і це може бути пов'язано зі способом проникнення сироваткових антитіл у молочну залозу.

Тому під час інтерпретації результатів важливо враховувати, що зразки молока можуть давати нижчі за очікувані показники, порівняно з сироваткою, і це залежатиме від клінічного анамнезу інфекції M. bovis, кількості лактацій, стадії лактації та поточного стану здоров'я щодо мікоплазмового маститу.

Альтернативним застосуванням ІФА є виявлення контакту з M. bovis на рівні стада за допомогою танкового молока. Такий підхід застосовується для оцінки ризиків біобезпеки під час придбання тварин зі стада з невідомим статусом M. bovis. Через легкість збору та його репрезентативність зразок танкового молока, зазвичай, використовується для ПЛР як інструмент спостереження за поширеністю Mycoplasma spp. на рівні стада в різних регіонах та країнах.

Інфекційний кератокон'юнктивіт (ІКК) великої рогатої худоби є найпоширенішим та найважливішим очним захворюванням ВРХ. До ІКК причетні багато різних мікроорганізмів, включаючи Moraxella spp. та кілька видів Mycoplasma. Серед мікоплазм Mycoplasma bovoculi була широко виділена з кон’юнктивальних мазків з уражених очей. Експериментально було продемонстровано, що попереднє інфікування шляхом очного закапування M. bovoculi посилює та подовжує колонізацію Moraxella bovis.

Спостереження, що M. bovoculi та Moraxella spp. можуть бути виділені при коінфекції, також свідчить про те, що M. bovoculi може відігравати певну роль у розвитку синдрому ІКК. Оскільки не всі клінічні діагностичні лабораторії регулярно проводять виділення Mycoplasma spp., поширеність цього класу мікроорганізмів невідома. ІКК є досить поширеним синдромом, що частіше зустрічається в дорослої великої рогатої худоби, але також може спостерігатися в телят та молодих телиць.

Кілька мікоплазм пов'язують з іншими захворюваннями великої рогатої худоби. Найважливішою з них і, безумовно, найбільш недооціненою є M. dispar, яка, як було показано, викликає враження в гнотобіотичних телят. Вона також широко зустрічається в легенях худоби з пневмонією. Відсутність хороших діагностичних тестів для цієї мікоплазми означає, що її поширеність залишатиметься недостатньо зареєстрованою.

Окремі види мікоплазм можуть колонізувати урогенітальний тракт молочної худоби. Однак, взаємозв'язок між Mycoplasma spp. та репродуктивною продуктивністю в молочних стадах залишається до кінця незрозумілим. Mycoplasma spp. виділялася з піхви до (1,9%) та після контакту з биком (3,2%). Серед різних мікоплазм найчастіше виділяли Mycoplasma bovigenitalium (87,5%) та Mycoplasma californicum (9,3%). Корови, які не запліднились до відбору проб після контакту з биком, мали набагато більшу ймовірність виділення Mycoplasma spp. з піхви порівняно з тими, які запліднились. Крім того, серед тих, хто завагітнів, відтерміноване зачаття збільшувало ймовірність виділення Mycoplasma spp. з піхви під час відбору проб після контакту з биком.

Ймовірно, корови, які довше не стають тільними, частіше отримують зі спермою (можливо неодноразово) та згодом колонізуються Mycoplasma spp. (переважно M. bovigenitalium) саме статевим шляхом. У молочних стадах, де використовують биків, існує більша ймовірність виділення M. bovigenitalium після спаровування з піхви корів, які довше залишалися неплідними.

Фахівці НДЦ Biosafety-Center ДДАЕУ мають значний досвід діагностики захворювань, асоційованих як з M. bovis, так і Mycoplasma spp. З нашою допомогою багатьом підприємствам вдалося впровадити діагностичні схеми виявлення мікоплазм методами ПЛР для виявлення Mycoplasma spp. і M. bovis та ІФА для оцінки превалентності M. bovis у стаді. Крім того, напрацьовано стратегії контролю та ефективності боротьби з мікоплазмовими маститами і пневмоніями. Спеціалісти Biosafety-Center продовжують вивчати поширеність та етіологічної ролі різних видів мікоплазм у розвитку кератокон’юнктивітів, артритів та урогенітальних захворювань. Будемо раді нашій співпраці!

www.biosafety-center.com

Тел.: +38 (095) 063-05-31; +38 (096) 093-03-76

                                      Email: plppm@ua.fm

У 2025 році плануємо випуск шести номерів журналу «Молоко і ферма» — традиційно наприкінці кожного парного місяця. Читачі мають нагоду оформити передплату як друкованої, так і електронної версії журналу. Частково публікуватимемо матеріали у відповідній рубриці на сайті www.milkua.info. Більше інформації щодо передплати: 067 445 19 59 (Viber).